Selfmade In Vitro

Als erstes brauchen wir mal etwas worauf die Pflanze wachsen kann. Also mache ich mir meinen Nährboden selber. Die Herstellung ist relativ einfach. Ich werde mich jetzt durch verschiedene Dünger und Düngekombinationen durch probieren. Hier mein erster Plan.

Punkt 1: Nährbodenherstellung

Notwendige Geräte und Utensilien:

  • Becherglas 250 ml Herdplatte
  • Briefwaage
  • Glas oder Metalltrichter Backofen
  • Impföse oder ähnliches zum Umrühren des Mediums

Notwendiges Verbrauchsmaterial:

  • Kulturgläser
  • Küchenrolle
  • Destilliertes Wasser
  • Klebeschilder
  • Agar-Agar Pulver
  • Reinigungsalkohol oder 70%iger Ethanol Nährmittel (Dünger, Wurzelhormone)
  • Aluminium Folie
  • Gummiringe

Kulturgefässe für die Aussaat (Muttergefässe)

Reagenzgläser sind für Aussaat ideal weil diese sehr wenig Platz einnehmen und sich beim Umlegen der Protokorme in grössere Gefässe nur sehr wenig erhitzen. Würde man für die Aussaat kurze Gefässe verwenden, dann liegen diese beim Umlegen komplett im Dampfstrom und erwärmen sich so sehr rasch was den Protokormen nicht gut bekommt. Verwendet man Reagenzgläser als Muttergefäss, dann kann das Medium mit den Protokormen über den Topfrand herausragen während die Öffnung im Dampfstrom bleibt.

Kulturgefässe fürs Umlegen

Man sollte darauf achten, dass die Gläser keine zu grosse Öffnung haben und die Höhe der Gläser mindestens 10 cm beträgt. Verwendet man Gläser mit grösseren Öffnungen als 10 cm, dann steigt das Kontaminationsrisiko stark an weil der Platz im Dampfstrom nur begrenzt ist und sehr leicht insterile Umgebungsluft in das Glas gelangt. Die Höhe der Gläser sollte 10 cm nicht unterschreiten weil sonst die Pflanzen sehr bald am Deckel anstehen und das Wachstum verlangsamen bzw. einstellen. Ich bevorzugen die Gläser der Firma Weck aber auch Gläschen von Babynahrung (z.B. HIPP, Alete) werden funktionieren.

Vorbereiten der Kulturgläser

Bevor man die Gläser für die in vitro Kultur verwenden kann, muß man diese gründlich von Etiketten und eventuell vorhandenen Speiseresten (Marmelade, …) reinigen. Hierfür eigenen sich Reinigungsalkohol recht gut wobei aber wichtig ist, dass die Gläser nach dem Reinigen gut abgewaschen werden um Alkoholrückstände zu entfernen. Der Deckel

sollte gut schließen und darf beim Reinigen nicht vergessen werden. Die sauberen Gläser werden jetzt mit einem Stück Küchenrolle trockengerieben und verschlossen bis zu deren Einsatz aufbewahrt. Da das Trockenreiben von Reagenzgläser (speziell die Innenseite) eher mühselig ist spülen ich meine Reagenzgläser nach dem Waschen mit destilliertem Wasser aus, trocknen nur die Aussenseite ab und lassen sie an der Luft trocknen. So vermeide ich lästige Kalkflecken in den Reagenzgläser und ersparen uns das Trockenreiben der Innenseite.

WICHTIG: Da die Gläser bei Sterilisieren im Backrohr ca. 150 Grad aushalten müssen, sind sie auf deren Tauglichkeit zu überprüfen. Die Gläser dürfen keinen Kunststoffdeckel haben.

Ansetzen des Nährbodens (Medium)

1. Die notwendige Menge an Dünger/Wurzelhormon für den Nährboden (siehe Beipackzettel oder Aufdruck auf der Flasche) mit Hilfe einer Briefwaage abwiegen.
2. Da im Medium kein Geliermittel enthalten ist, muss man noch Agar-Agar Pulver vorbereiten. Ich verwende für meine Nährböden 6 – 7 Gramm Agar-Agar pro Liter Nährmedium.
3. Das Backrohr einschalten und auf 150 Grad vorheizen.
4. Etwa 2/3 der gewünschte Menge destillierte Wasser in das Becherglas füllen und den Dünger einrühren.
5. Solange destilliertes Wasser zugeben bis die endgültige Menge erreicht ist und danach noch einmal gut umrühren.
6. Den pH-Wert mit Hilfe von Teststreifen oder pH-Meter feststellen. Der pH-Wert sollte je nach Pflanze angepasst werden. Ist der Wert zu niedrig, dann kann man durch vorsichtiges Hinzugeben von NaOH den pH-Wert erhöhen. Ist der pH-Wert zu hoch, dann kann man diesen durch vorsichtiges Hinzugeben von HCl senken.
7. Jetzt kann man das Becherglas auf den Herd stellen und das Medium erhitzen.
8. Sobald die ersten Dampfblasen vom Boden des Becherglases aufsteigen kann man mit dem Einrühren des Agar-Agar Pulver beginnen.
9. Das Medium ca. 2 Minuten leicht kochen lassen wobei man aber darauf achten muss, dass das Medium nicht aufschäumt.
10. Den flüssigen Nährboden in die Kulturgefässe füllen und darauf achten, dass das Nährmedium nicht auf den Hals der Kulturgefässe kommt weil sonst Kontaminationen (Pilze, …) sehr leicht in das Gefäss kommen können. Bei sehr engen Gefässen (z.B. Reagenzgläser, Flaschen, …) ist ein Glastrichter sehr zu empfehlen.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

11. Den Deckel der Kulturgefässe auf die befüllten Gläser legen, aber nicht festschrauben weil im Backrohr durch die Hitze ein Überdruck im Kulturglas entsteht der das Glas beschädigen könnte wenn dieses fest verschlossen ist. Hat das Gefäss (z.B. Reagenzgläser, Flasche) keinen hitzebeständigen Schraubverschluss, dann muss man in die Öffnung einen Wattpfropfen stecken.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

12. Im nächsten Schritt werden die Gefässe mit Alufolie abgedeckt und ins vorgeheizte Backrohr gestellt. Bei Reagenzgläser ist es empfehlenswert diese in ein Drahtgestell zu stellen und dieses mit Alufolie zu umwickeln damit die einzelnen Alufolienkappen nicht abgehoben werden (beim Erhitzen entweicht Luft die die Folie sonst wegschiebt).

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

13. Das Backrohr nach 30 Minuten abschalten und die Gläser bei geschlossener Ofentüre langsam abkühlen lassen. Ich setze meine Nährböden immer nach dem Abends an, dann wird der Herd nicht mehr benötigt und die Gläser können in Ruhe über Nacht abkühlen.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

14. Ist das Backrohr ganz ausgekühlt, dann kann man die Gläser aus dem Ofen holen und an einem hellen Ort abstellen. Vorsicht bei Angreifen der Gläser damit man die Alufolie nicht unnötig bewegt (Kontaminationsgefahr). Man sollte die frischen Nährböden vor dem Gebrauch zumindest 5 Tage (besser eine Woche) stehen lassen weil in dieser Zeitspanne eventuelle Kontaminationen ausreichend Zeit haben zu wachsen. Sind die Gläser nach 5 Tagen immer noch steril, dann kann man ziemlich sicher davon ausgehen, dass die Nährböden für den weiteren Gebrauch (Aussaat, Umlegen, …) brauchbar sind.

Herstellen von sterilen destillierten Wasser

Um steriles destilliertes Wasser zum Spülen der Samen zu bekommen, füllt man einfach etwas Wasser in ein verschraubbares Glas, legt den Deckel lose auf das Glas und deckt den Deckel mit Alufolie ab. Das Glas kann dann gemeinsam mit den Nährböden 30 Minuten lang im Backrohr sterilisiert werden.

Punkt 2: Das Einsetzen von Pflanzenteilen

Notwendige Geräte und Utensilien:

  • Gitterrost Kochtopf Spirituskocher Handschuhe Impföse Pinzette Skalpell
  • Notwendiges Verbrauchsmaterial:
  • Kulturgläser mit Medium
  • Küchenrolle
  • Reinigungsalkohol oder 70%iger Ethanol
  • DanKlorix (Chlorreiniger)
  • verschraubbares Glas (z.B. kleines Marmeladeglas) Wattepads

Vorbereiten des Arbeitsplatzes:

Bei der hier beschrieben Methode wird der aufsteigende Wasserdampf über dem Kochtopf als steriler Arbeitsbereich genutzt. Sehr wichtig ist, dass in dem Raum jede vermeidbare Zugluft unterbunden wird (Fenster schließen). Wie man die einzelnen Komponenten aufstellt, kann man nur durch Probieren herausfinden. Bei mir (Rechtshänder) hat sich folgende Aufstellungsordnung als am besten erwiesen. Die Kerze steht so nah wie möglich rechts neben dem Kochtopf auf einem Korkuntersetzter (für Kochtöpfe). Rechts neben der Kerze befindet sich das Fläschchen 70%iger Ethanol in dem alle Instrument (Pinzette, Impföse) stehen und dort auf ihren Einsatz warten. Unmittelbar links neben dem Topf befindet sich ein in Ethanol getränktes Küchentuch auf dem die Alukappen abgestellt werden. Weiter links befinden sich die Kulturgläser mit den Nährmedien (auf dem Bild unten nicht zu sehen).

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

Weitere Arbeitsgänge:

Den Kochtopf etwa 3 cm mit Wasser füllen und zum Kochen bringen. Die Temperatur der Herdplatte ist so zu wählen, dass das Wasser immer kocht. Sobald das Wasser kocht nimmt man den Deckel von Topf, reinigt den Gitterrost mit einem Stück in 70%igen Ethanol getränkter Küchenrolle und legt den Rost auf den Topf.

WICHTIG: Alle Schritte müssen in Dampfstrom durchgeführt werden.
Offene Reagenzgläser und deren Verschlüsse (ausgenommen Alufolienkappen) dürfen den Dampfstrom nicht verlassen.

Desinfektion von Aquariumpflanzen:

Zu Beginn sollte man die Pflanze gründlich auf eventuell vorhandene Schädlinge oder Parasiten untersuchen da durch diese zusätzlich auch Pilzsporen in die Zuchtgefäse eindringen können. Danach kann man abgestorbene und andere unerwünschte Teile vorsichtig entfernen. Die nun fein säuberlich zerlegten Pflanzenteile werden nun in verschiedene Tauchbäder gegeben um sie von den restlichen Bakterien und Parasiten zu befreien. An der genauen Rezeptur feile ich noch 😉 Aber soviel sei gesagt, in der aktuellen Versuchsanordnung werden die Pflanzen folgende Bäder durchlaufen:

  1. Mineralwasser (stark Sprudelnd)
  2. Alaunlösung
  3. Mineralwasser (stark Sprudelnd)
  4. Essiglösung
  5. Mineralwasser (stark Sprudelnd)
  6. Kaliumpermanganatlösung
  7. Mineralwasser (stark Sprudelnd)

An den optimal Konzentrationen schraub ich grad noch etwas rum aber das wird schon. Als nächstes nimmt man das verschraubbare Glas und spült es gründlich mit Ethanol aus. Der Alkohol wird abgegossen das Glas mit Destiliertem Wasser ausgespült und die Pflanzenteile dort hinein gelegt.

Aufbringen der Pflanzenteile auf dem Nährboden:

1. Nachdem die Pflanze nun sterilisiert wurde nimmt man einen Wattepad, tränkt diesen mit 70%igen Ethanol und legt ihn im Dampfstrom am Gitterrost ab. Jetzt nimmt man das Glas in dem die Pflanzen liegen, öffnet es im Dampfstrom und legt den Deckel am

Küchentisch ab. Während die eine Hand das Glas im Dampfstrom hält nimmt man mit der anderen Hand die Pinzette, flammt diese ab und entnimmt damit eine Pflanze. Die Pflanze wird auf dem ethanolgetränkten Wattepad im Dampfstrom abgelegt, das Glas kann man am Küchentisch abstellen. Jetzt schwenkt man die Pinzette kurz im kochenden Wasser und stellt sie zurück in den Ethanol.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

2. Jetzt nimmt man eine Reagenzgläser mit Nährmedium und entfernt im Dampfstrom die Alufolienkappe. Die Kappe legt man neben dem Kochtopf auf dem ethanolgetränkten Küchentuch ab.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

3. Als nächstes flammt man die Pinzette ab und entfernt damit den Wattepfropfen den man am Gitterrost ablegt.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

4. Ist das erledigt, flammt man die Impföse ab. Dann nimmt eine Pflanze auf um sie auf direkten Weg in ein Reagenzglas zubringen und dort auf den Nährboden zu setzen. Danach schwenkt man die Impföse kurz im kochenden Wasser und stellt sie zurück im Ethanol.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt
aussaatgruen6
Quelle: Oliver Hardt

5. Jetzt steckt man den Wattepfropfen in die Reagenzgläser. Die Pinzette wird danach kurz im kochenden Wasser geschwenkt und zurück in den Ethanol gestellt.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

6. Als nächstes nimmt man die Reagenzgläser und flammt das Ende des Wattepfropfens kurz ab (die Reagenzgläser dabei einmal um die eigene Achse drehen).

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

7. Ist das erledigt, nimmt man die Alufolienkappe und schiebt diese über den Wattepfropfen. Um die Folienkappe vor Verrutschen zu sicher versehen wir jede Reagenzgläser mit einem Gummiring der die Alufolie an die Reagenzglaswand drückt.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

Einige Tipps:

Das Kulturglas darf vom Öffnen bis zum Schließen des Deckels den Dampfstrahl nicht verlassen. Die Öffnung des Glases sollte nicht steiler als 45 Grad zum Wasserdampf stehen (nicht aufrecht hinstellen) keine schnellen Bewegungen machen während offene Kulturgläser im Dampfstrom liegen während dem Arbeiten über Dampf durch die Nase athmen und möglichst nicht sprechen. Aufstellen der Kulturgläser: Die mit Pflanzen versehenen Kulturgefässe sollten möglichst hell und warm (ca. 20 – 25 Grad) stehen. Es ist darauf zu achten, dass die Gläser keiner direkte Sonne ausgesetzt werden, weil dadurch die Temperatur im Inneren zu sehr ansteigt und möglicherweise die Aussaat vernichtet. Weiters sollte der Ort keinen starke Temperaturschwankungen (z.B. beim Lüften am Fensterbrett im Winter) ausgesetzt sein weil es bei wechselnder Temperatur zu einer Druckänderung in unseren Gläsern kommt und unter Umständen Luft in das Glas gesaugt wird. Wir stellen unsere Kulturgläser zwischen den Orchideen am Fensterbrett auf. Es ist zu empfehlen die Gläser an verschieden Orten mit unterschiedlichen Lichtbedingungen aufzustellen. Dadurch bekommt man rasch ein Gefühl dafür welche Pflanze unter welchen Bedingungen am besten keimen.

Punkt 3: Umlegen der Pflanzen

Notwendige Geräte und Utensilien:

  • Gitterrost
  • Kochtopf
  • Kerze
  • Handschuhe
  • Impföse

Notwendiges Verbrauchsmaterial:

  • Kulturgläser mit Medium
  • Küchenrolle
  • 70%iger Ethanol

Wann soll man die Pflanzen umlegen ?

Grundsätzlich sollte man die Pflanzen so lange auf dem Aussaatmedium lassen solange sie sich nicht gegenseitig im Wachstum behindern bzw. Wurzeln bilden. Je kräftiger die Pflanze zum Zeitpunkt des Umlegens sind desto leichter überstehen sie das Ganze. Ich säen pro Mutterglas relativ wenig „Setzlinge“ aus und kann daher mit dem Umlegen länger warten bis die Pflanzen etwas stärker sind.

Vorgehensweise:

WICHTIG: Alle Schritte müssen in Dampfstrom durchgeführt werden. Offene Gläser und deren Verschlüsse (ausgenommen Alufolienkappen) dürfen den Dampfstrom nicht verlassen.

1. Zuerst nimmt man die Reagenzgläser mit den Setzlingen die umgelegt (überimpft) werden sollen und entfernt die Alufolienkappe. Die Kappe wird neben dem Kochtopf auf ein Stück mit 70%igen Ethanol getränkte Küchenrolle gelegt. Jetzt nimmt man eine Pinzette, flammt diese ab und zieht damit den Wattepfropfen aus der Reagenzgläser. Der Wattepfropfen und die Pinzette werden am Gitterrost abgelegt. Die Reagenzgläser wird so auf den Rost gelegt, dass der Nährboden über den Topf hinaus ragt und sich die Öffnung der Reagenzgläser im Dampfstrom befindet.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

2. Als nächstes nimmt man eine frisches Kulturglas in das die Setzlinge überimpft werden sollen und entfernt im Dampfstrom die Alufolie.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

3. Nachdem man die Alufolie entfernt hat nimmt man den Deckel des Glases ab und legt ihn mit der Öffnung nach unten auf den Gitterrost. Das Glas wird ebenfalls auf den Rost abgelegt.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

4. Nun flammt man die Impföse ab, kühlt die Spitze kurz im Medium auf dem die Setzlinge liegen ab und entnimmt diese. Bei Abkühlen der Impföse sollte man ein Stück Nährboden wählen auf dem nicht viele Pflanzen liegen. Die entnommen Setzlinge werden auf kürzestem Weg in das neue Glas gebracht und dort auf dem Nährboden verteilt. Es ist besser nicht zu viele Setzlinge zu überimpfen weil sich diese meist noch teilen.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt
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5. Jetzt schwenkt man die Impföse kurz im kochenden Wasser und stellt sie zurück in den 70%igen Ethanol. Das frischbeimpfte Glas wird mit seinem Deckel verschlossen und neben dem Kochtopf auf der Arbeitsfläche abgestellt.

Quelle: Oliver Hardt
Quelle: Oliver Hardt

6. Mit den weiteren Gläser verfährt man in der selben Reihenfolge.

Punkt 4: Abwarten ob es was wird

So ich hoffe ihr hattet Spaß beim lesen ich werde wieder was dazu schreiben sobald ich was neues sehe.

Quelle: Oliver Hardt

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